Seiring berkembangnya ilmu pengetahuan, muncullah ilmu Yang mempelajari mengenai pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang yang dikenal sebagai  Teknologi DNA rekombinan atau biasa disebut rekayasa genetika. Teknologi ini memungkinkannya diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar dari pada produksi secara konvensional serta memadukan sifat dari dua jenis organisme yang berbeda (organisme transgenik).

Teknik DNA Rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi.

1. Stategi  isolasi DNAIsolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid.

2. Enzim andonuklease RestriksiSecara alamiah bakteri menghasilkan enzim endonuklease untuk mempertahankan dirinya dari keberadaan DNA asing yang masuk kedalam sel bakteri. Enzim endonuklease restriksi yang sangat selektif dalam memotong untai DNA, sangat bermanfaat bila diaplikasikan pada teknologi DNA rekombinan. Setiap enzim mengalami rangkaian 4-8 pasang basa tertentu yang terdapat dalam untai DNA.

3. Enzim andonuklease Restriksi
Pada gambar diatas dapat dilihat misalnya enzim restriksi EcoRI,memotong molekul DNA pada urutan heksa-nukleotida 5’—GAATTC—3’ pada posisi antara basa G dan A. demikian pula pada urutan polindromiknya 3’—CTTAAG—5’ enzim EcoRI, juga memotong pada posisi antara basa A dan G. dengan demikian molekul DNA heliks ganda yang terpotong oleh enzim EcoRI, menghasilkan fragmen restriksi dengan kedua ujung yang lengket.

4. Ligasi

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan, Artinya, fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.

Tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro

  1. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri
  2. ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-selE. coliyang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.
  3. yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Vektor

Vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E.coli, adalah plasmid, bakteriofag, kosmid dan fosmid.

Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:

  1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya
  2. Mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,
  3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA
  4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

Teknik menyisipkan DNA target padaplasmid

Picture1.png

Transfer molekul DNA rekombinan ke dalam sel merupakan tahap yang penting pada teknologi DNA rekombinan. Beberapa spesies bakteri yang sering digunakan dalam industri bioteknologi antara lain adalah Eschericia coli.

Transformasi

Teknik ini digunakan apabila vektor yang dipakai adalah plasmid DNA. Dapat ditransformasikan kedalam sel inag dengan cara

Elektroporasi

Permeabilitas dinding sel bakteri dapat ditingkatkan dengan cara menempatkan sel bakteri kedalam medan listrik yang kuat DNA dan sel bakteri dimasukkan bersama-sama dalam kuvet khusus yang kemudian ditempatkan dibawah medan listrik (1,8 kv), dalam waktu yang sangat singkat sekitar 4-5 detik.

Konjugasi

Proses ini umumnya terjadi secara alamiah diantras sel bakteri melalui pili bakteri. Pada transfer DNA melalui konjugasi diperlukan jenis plasmid khusus yang disebut dengan plasmid konjugatif.

Induksi kimia

menggunakan perlakuan kejut panas kejut panas (heat shock) dengan CaCl2 pada suhu 42oC dalam waktu 90 detik.


Macammacam teknik transfer DNA adalah:

Transfeksi

Proses transfer DNA melalui transfeksi ini menyerupai proses infeksi oleh virus yang terjadi secara alamiah. Replikasi dan propagasi akan meningkatkan jumlah DNA rekombinan.

Mikroinjeksi

Teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA secara langsung kedalam sel menggunakan jarum suntik yang merukuran sangat kecil atau mikro. Umumnya teknik ini digunakan untuk mentransfer DNA kedalam sel hewan karena sel tersebut berukuran relative lebih besar daripada sel bakteri.

 Mikroprojektil

Teknik ini umumnya digunakanuntuk mentransfer DNA kedalam sel atau jaringan tanaman. Partikel DNA ditembakkan langsung dengan suatu alat penembak khusus langsung kedalam sel tanaman.

Picture2.png

Contoh transformasi plasmid rekombinan pada bateri E.coli


Sleksi (Screening)

DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk Memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannyamembawa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.

Teknik melakukan Screening.

picture3

Seleksi

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak  (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chainreaction (PCR) Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan hibridisasi koloni.

picture4

Skema kloning, proses dimulai dari transfer gen kedalam plasmid hingga kultivasi sel host

Disusun : Hendra BDP Politeknik Negeri Jember

Advertisements